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CaCo-2细胞模型法

浏览数量: 0     作者: 本站编辑     发布时间: 2021-12-02      来源: 本站

CaCo-2细胞模型法

CaCo-2细胞模型法评价SNAC对Semaglutide肠吸收影响的实验

方案草案

1、CaCo-2 细胞模型简介

CaCo-2细胞系人结肠腺癌细胞(the human colonadenocarcinoma cell line)是一种结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞,具有微绒毛等结构,并含有与小肠刷状缘上皮相同的酶系统,也具有小肠上皮类似的胞饮功能,可以用来进行模拟体内肠转运的实验。在细胞培养条件下,CaCo-2细胞生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为类肠上皮细胞,形成连续的单层。

2、CaCo-2 细胞模型的运用

现代药物研发成功与否,与药物的代谢特性密切相关。人工合成和筛选的化合物已被大规模的高通量筛选所取代,无论是开发新药还是开发新的给药途径,化合物在体内的吸收特性都具有突出的地位。以往传统的体内药代吸收筛选模型,由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端,已经无法满足现代新药的研发要求,因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。被广泛采用的三种筛选方法是:大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及CaCo-2细胞模型法。其中,CaCo-2细胞模型法已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。

人类小肠上皮中的各种转运系统、代谢酶等在CaCo-2细胞中也有相同的表达,如细胞色素P450同工酶、谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶。同时糖、氨基酸、二肽、维生素等多种主动转运系统在CaCo-2细胞中都有与小肠上皮细胞类似的表达,非常接近药物在人体内吸收的实际环境。

小肠上皮的代谢、受体介导的转运、p-gP对药物分子的泵出,均为酶学饱和的动力学。联合用药时,因为存在药物相互竞争的酶、载体或p-gP的作用,所以与单独给药时的生物利用度存在差异,这一相互作用可以通过CaCo-2细胞模型进行研究。尤其近年来发现p-gP成为药物吸收的一个重要生化屏障,它把进入细胞内的药物泵出,因此成为口服药物生物利用度低、波动大的一个重要影响因素。CaCo-2细胞具有p-gP的表达,非常适合用吸收机制的深入研究。

3、Semaglutide的口服吸收研究

已有文献报道,Semaglutide 5mg,SNAC150mg或300mg能显著增加Semaglutide在胃内的吸收,本研究运用CaCo-2细胞模型法探讨SNAC是否能够促进Semaglutide在小肠吸收。

3.1研究方法:

3.1.1实验材料

CO2培养箱,倒置显微镜,冷冻高速离心机,超净工作台,水浴锅,酶标仪,培养皿,冻存管,移液枪,培养基,Transwell等。

3.1.2供试品

Semaglutide原料,由杭州先为达生物科技有限公司提供,批号:  

SNAC,由成都普康生物科技有限公司提供,批号:   COA见附件。

鹅去氧胆酸,由成都普康生物科技有限公司提供。

3.1.3实验方法

3.1.3.1细胞培养阶段

细胞来源:中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(白人,男性,72岁)。常规方法复复苏细胞,形成细胞悬液。接种到Transwell后,于第7、14、21天做碱性磷酸酶活性检测,判断CaCo-2细胞在生长的分化程度;于第7、9、11、13、15、17天检测CaCo-2 细胞单层跨膜电阻值(Transepithelial Electrical Resistance,TEER) ,当 TEER 值稳定在500−1500 Ω·cm2 之间时,表明其单层膜达到致密性,具有转运和吸收功能;在第21天做苯酚红的通透性实验,计算表观渗透系数,小于1 x 106,即说明单层膜细胞连接紧密完整性良好。以上验证完成后即表明Caco-2 细胞模型的构建完成,可作为模拟小肠体外转运模型。

3.1.3.2 Semaglutide细胞毒性试验

根据Semaglutide口服制剂规格,评价Semaglutide  1~20ug/ml浓度范围内,CaCo-2 细胞存活率,选择无细胞毒性浓度区间进行后期实验。初步估算浓度可选择2.5ug/ml。

3.1.3.3 SNAC及鹅去氧胆酸细胞毒性试验

根据既往研究经验,SNAC在50ug/ml到200ug/ml之间,细胞存活率无影响;在200ug/ml到800ug/ml,细胞存活率显著下降。初步决定SANC试验浓度为200ug/ml。

根据既往研究经验,鹅去氧胆酸试验浓度为10~15mmol/L

3.1.3.4 SNAC对Semaglutid吸收影响试验

实验分组如下:

组别

药物

(以终浓度计)

备注

Semaglutide组

Semaglutide 2.5ug/ml


Semaglutide+SNAC组

Semaglutide 2.5ug/ml

SNAC 75ug/ml


Semaglutide 2.5ug/ml

SNAC 150ug/ml


Semaglutide+胆酸盐组

Semaglutide 5ug/ml

鹅去氧胆酸15mmol/L

可选做

Transwell上室加药,下室取样检测药物浓度,每组3复孔。各组分别于加样后5min,15min,30min,45min,60min,90min取样检测,每次取样50ul~100ul,并根据取样体积补足液体,后期计算分析中计算累积渗透量及渗透率。

取样后-80℃冰箱保存,干冰邮寄至杭州先为达生物科技有限公司进行检测,检测数据反馈后计算渗透率。

测试分析方法:略

计算分析:略

4、研究经费

康宁公司Transwell一板为12孔,做3复孔可以同时做4个样品,本实验室一次细胞培养可做6板,最多可评价24个样品,能够实现较大样品/方案的筛选,为保证质量,每次建议做1~4板。结合多年研究经验,本实验室按照Transwell板数量进行收费。

项目

单次实验费用

不足1板按照1板收费

18000.00元

(含细胞培养及取样费用)

2板

22000.00元

3板

24000.00元

4板

26000.00元

检测费

检测方法另行商议

取样点

6个取样点内均不加收费用

6个取样点以上每个取样点500.00元


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